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Luciferase检测

、服务简介

双荧光素酶实验,使用2种荧光素酶报告基因,分别萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)、海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)。这2种酶的基因一般分别构建在2个载体上;本公司将2种酶同时构建在1个载体上,可供选择。

荧火虫荧光素酶是从甲虫(Photinus pyralis)中分离得到,分子量为61kDa;而海肾荧光素酶则是从海肾(Renilla reniformis)中分离,分子量为36kDa。这两种酶的区别之一是底物和辅因子不同:萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光;而海肾荧光素酶仅需要腔肠素和氧气。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的区别之二是发光的颜色不同:萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色,波长550-570nm;而海肾荧光素酶产生蓝光,波长480nm。

二、技术流程

1) 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点,或者3’UTR区可能的miRNA结合位点。

(2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶序列DNA片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒中;如需过表达转录因子,需要合成并构建转录因子过表达载体;如果涉及到miRNA,需要合成miRNA。

(3)筛选阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

(4)培养293T细胞,或其它目的细胞,并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%汇合度)。

(5) 将相关的报告基因质粒、转录因子表达质粒、miRNA等(转录因子表达质粒、miRNA有些实验不需要)共转染细胞。转染细胞的时候,确保互为对照质粒保持摩尔数相同。

(6)裂解细胞,获得细胞裂解液用于荧光素酶检测。

(7)依照双荧光素酶检测试剂盒的protocol操作。基本步骤如下:加入细胞裂解液;加入萤火虫荧光素酶底物,测定荧光素酶的活性;加入海肾荧光素酶底物,测定荧光素酶的活性。

(8)计算相对荧光强度,并进行数据分析。

三、荧光素酶报告基因的优点

(1)优越的灵敏度,比Westernbloting灵敏度高1000倍以上;

(2)内源性低,哺乳动物无内源性表达;

(3)荧光素酶检测不受细胞内其他物质影响;

(4)发光检测,检测方便;

(5)灵敏度高,10-20摩尔荧光素酶分子;

(6)检测范围广,大于7个数量级。


共享资料

             双荧光素酶实验常见问题分析.pdf


参考资料:

1. Nicolas, F.E., Experimental Validation of MicroRNA Targets Using a Luciferase Reporter System, in MicroRNAs in Development: Methods and Protocols, T. Dalmay, Editor. 2011, Humana Press: Totowa, NJ. p. 139-152.

2. Zhu, J., et al., TNF-alpha mRNA is negatively regulated by microRNA-181a-5p in maturation of dendritic cells induced by high mobility group box-1 protein. Sci Rep, 2017. 7(1): p. 12239.

3. Zhu, S., et al., MicroRNA-21 targets the tumor suppressor gene tropomyosin 1 (TPM1). J Biol Chem, 2007. 282(19): p. 14328-36.

4. Shimono, Y., et al., Downregulation of miRNA-200c links breast cancer stem cells with normal stem cells. Cell, 2009. 138(3): p. 592-603.

5. Pan, Y., R. Geng, N. Zhou, G. F. Zheng, H. Zhao, J. Wang, C. M. Zhao, X. B. Qiu, Y. Q. Yang and X. Y. Liu (2015). "TBX20 loss-of-function mutation contributes to double outlet right ventricle." Int J Mol Med.


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